Nach mechanischem und thermischem Aufschluss soll die Cellulose mittels Enzymen in ihre Einzelbausteine zerlegt werden. Die Einzelzucker, allen voran die Glucose, werden in der Fermentation von den Hefen abgebaut. Zum Aufschluss der Cellulose werden Cellulasen eingesetzt, die in ihre Hauptwirkung unterteilt werden: Exocellulasen schneiden die Glucosebausteine an den Enden der Cellulose ab, Endocellulasen schneiden die Cellulose in kleine Stücke. ß-Glucosidasen trennen die aus zwei Glucosemolekülen bestehende Cellobiose in die zwei Einzelzucker.

Die Hemicellulose besteht zum größten Teil aus Xylose und Arabinose. Die Hemicellulose wurde bereits während des Druckaufschlusses weitestgehend aufgeschlossen. Die Reste werden von Hemicellulasen nun weiter in ihre Bestandteile zerlegt. Mit genetisch modifizierten Hefen ist es möglich, auch diese Zucker zur Ethanolproduktion heranzuziehen.

Um eine ausreichend hohe Enzymaktivität zu erreichen, muss die Temperatur angepasst werden, zumeist um die 50-60°C sowie ein Rührwerk eingesetzt werden. In diesem Projekt wurden Enzyme von Erbslöh Geisenheim für die Hydrolyse verwendet. In den Abbildungen sind zwei Hydrolyseapparaturen dargestellt. Im Rolleninkubator wird der Maischebehälter langsam gedreht und damit nur wenig Rührenergie eingetragen. Im Maischbad rühren Rührblätter mit hoher Geschwindigkeit den Maischansatz. Der höhere Energieeinsatz resultiert in stärkeren Scherkräften und einer schnelleren Hydrolyse. Bei bestimmten Substraten wie Maissilage oder Topinambur ist allerdings der geringere Energieeintrag bereits ausreichend.